Получение нейронов из ЭСК. Эмбриональные стволовые клетки

Уже в начале 90-х годов в печати появились первые протоколы наработки дифференцированных нейронов из ЭСК тератокарциномы (Yao M.,Bain G., GottliebD.L.,1995). Сперва незрелые клетки тератокарциномы размножали с помощью ростовых факторов в простой питательной среде с добавками. Затем клетки переводили в среду без ростовых факторов, в которую добавляли ретиноевую кислоту и В27 Neurobasal supplement. В новой среде селективно выживали только постмитотические нейробласты, а незрелые стволовые/прогениторные популяции погибали. В первых работах эффективность образования нейронов in vitro оставалась ниже 10 %. Однако эффективность лабораторного нейрогенеза можно значительно улучшить, если на первом этапе улучшить образование НСК из ЭСК. Сперва необходимо увеличить выход нестин+ клеток в культуре . Затем изолированную популяцию НСК размножали в селективной среде. Выход нейронов из высокоочишенной фракции НСК довели до 60-80%. В конце 90-х годов фирма BioLayton (Калифорния) оказалась первым частным собственником технологической линии с целью крупномасштабного выращивания нейронов человека по всем стандартам GМP. Из стандартного сырья стали готовить биотрансплантаты для лечения пациентов. Первоначально фирма купила университетский патент Пенсильванского университета (авторы - Virginia Lee, John Troyanovsky, No5792900), заявленный на способ изготовления нейротрансплантата в виде однородной популяции нейронов, полученных из плюрипотентных незрелых клеток эмбриональной тератокарциномы NT2N. Образование нейронов индуцировали добавлением сыворотки и ретиноевой кислоты под контролем следующих маркеров: нестин, NF-1, MAP-2C, alpha-internexin.Через 5-7 дней островки прикрепившихся незрелых клеток начинали синтезировать N-кадхерин и NCAM. Еще через три дня после добавления индукционной среды, состав которой запатентован, клетки образовали нейрофиламенты, увеличивали фосфорилирование компонентов цитоскелета и сигнальных белков. Еще через 10-13 дней культивирования 90-98% клеток приобретали фенотип нейробластов с характерными отростками. Примерно 4-5 нед уходило на созревание нейронов из ЭСК. Нейроны возникали не только из одиночных прикрепленных клеток, но и агрегатов ЭСК. Синхронно с появлением маркеров диффренцировки из клеток исчезал нестин. Более зрелые нейроны экспрессировали белок tau и MAP-2b. Согласно GLP-протоколу, до 95% клеток в культуре превращались в типичные нейроны с характерными отростками, электровозбудимой мембраной и секрецией медиаторов. Остальные незрелые примесные клетки высортировывали на поточном сортировщике клеток. Лабораторно полученные нейроны не ревертировали спонтанно к фенотипу тератокарциномы или незрелых клеток, не давали опухолей при введении в ткани животным. Лабораторно полученные нейроны фирмы BioLayton хорошо выживали после трансплантации в мозге животных-реципиентов. Часть клеток пролиферировала и встраивалась в локальные нейрональные сети (детали см. www.biolayton.com). На языке профиля мРНК рестрикционное созревание тератокарциномы NT-2 делилось на три этапа. (Przyborski S.A., Morton I.E., Wood A. et al., 2000). В первую фазу увеличивалось число нестин+ клеток, что совпадало с увеличением Notch-1 мРНК. Во вторую фазу роста мРНК NeuroD и снижения мРНК нестина происходило накопление пула прогениторных клеток. Фазу постмитотических зрелых нейронов верифицировали по накоплениею мРНК синаптофизина и энолазы и одновременному исчезновению мРНК NeuroD.
Пути дифференцировки нейробластов из ЭСК тератокарциномы прослеживали с помощью профиля экспрессии других генов. В случае дорзальных (чувствительных) нейронов первой появлялась мРНК гена Рах-7 после добавления ретиноевой кислоты. В случае вентральных нейронов первой детектировалась мРНК гена Рах-6. Появление клеток нервного гребня в культуре маркировали появлением мРНК генов Рах-7 и Erb3. Дальнейшее созревание сомато-мотонейронов маркировали экспрессией Islet-1, Islet-2, Lim-3, HB-9. Краниальные мотонейроны экспрессировали мРНК Islet-1, Islet-2, Phox-2b. Интернейроны экспрессировали мРНК Lim-1, Lim-2, Eng-1 (Renoncourt Y., Carroll P., Filippi P. et al., 1998).
Ключевым моментом созревания ДОПА-нейронов из ЭСК линии NT2 была экспрессия гена тирозингидроксилазы (ТГ). В культуре максимальное количество ТГ+ клеток удавалось получить с помощью трех индукторов : FGF-1, стимулятора внутриклеточного уровня цАМФ ( форсколина) и активатора протеинкиназы С ( форболового эфира –форбол-12-миристоил-13-ацетата). Эта «триада» вызывала появление 10-20% ТГ+ нейробластов. Однако путем двухнедельной инкубации в специальной среде для дифференцировки долю ТГ+ клеток удалось поднять до 75% ( Iacovitti L., Stull N.D., Jin H.,2001). In situ, т.е. в ходе эмбриогенеза ТГ+ нейробласты появлялись под влиянием других сигналов ( SHH и FGF8) ( Stull N.D., Iakovitti L., 2001). Эти данные показали, что лабораторные нейроны с выбранным профилем медиаторов реально получать «неприродным» альтернативным путем, в обход путей и сигналов эмбриогенеза мозга.
Другая стратегия наработки нейронов из линии ЭСК человека намечена сотрудниками фирмы Герон ( Carpenter M.K., Inokuma M.S., Denham J. et al.,2001). В суспензионной культуре ЭСК над фидером нарабатывают значительные массы эмбриоидных телец. Далее начальную дифференцировку запускают прикреплением агрегатов к подложке в среде с набором митогенов. Прикрепленные массы начинают расти незрелой тканью, в которой экспрессируются ранние гены нервной трубки. В ткани формируются клон-инициирующие клетки. Новообразованные клоны маркировались нестином, виментином, GFAP, PC-NCAM. Долю клонов НСК можно значительно увеличить путем подбора митогенов в селективной среде. При пересадке выращенной незрелой ткани, напоминающей нервную трубку, в мозг новорожденным мышам наблюдали интенсивную миграцию прогениторных клеток в разные отделы мозга с последующей дифференцировкой внейроны, глию и олигодендроциты ( Carpenter M., Inokuma M.S., Denman J., 2001)
Ретиноевая кислота оказалась первым незаменимым индуктором нейрогенинов или Neuro D на пути дифференцировки ЭСК в нейроны. Однако нет четких однозначных прописей получения холинэргических, ГАМК- или серотонинэргических нейронов на втором этапе дозревания бластных форм. Комбинации ростовых факторов, нейротрофинов и других индукторов в дучшем случае заканчивались смешанной дифференцировкой нейронов in vitro ( Takahashi J., Palmer T.D., Gage F.H., 1999). Существенно также, что нейрогенез in vitro, запускаемый ретиноевой кислотой, формировал нейроны из агрегатов, прикрепленных к поверхности крупных распластанных клеток ( по фенотипу –это клетки первичной эктодермы , либо нейромезенхимы )( Bain G., Kitchens D, Uao M. et al., 1995).